Transwell迁移/侵袭实验

        基本原理

        将Transwell小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。

        应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。侵袭实验中使用到的Matrigel 是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。

        Transwell小室的滤膜孔径一般为8μm，在侵袭实验中，膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel 的滤膜，这与体内情况较为相似。细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶（MMPs）将基质胶降解，方可通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。

        所需材料

ØTranswell小室

Ø细胞生长培养基

Ø胎牛血清

Ø胰蛋白酶

ØPBS

Ø青霉素-链霉素溶液（100×）

Ø结晶紫或台盼蓝

Ø甲醇

ØMatrigel（侵袭实验）

        主要试剂配置

（1）PBS磷酸盐缓冲液： PBS粉剂每袋加ddH2O定容至1000ml，调pH7.2，121℃，30min，高压灭菌，4℃保存。

（2）细胞生长培养基：低温培养箱-20℃保存，临用前按体积比配成含10% FBS和1%青霉素-链霉素双抗的*培养液。

        操作步骤

1．所有细胞培养试剂和细胞培养池放在电热恒温培养箱内37℃温育；

2．待测细胞培养至对数生长期，消化细胞，用PBS和无血清培养基先后洗涤1次，用无血清培养基悬浮细胞，计数，调整浓度为2×105 /ml；

3．如进行侵袭实验，将Matrigel胶从-20℃取出于4℃冰箱过夜，在4℃条件下将Matrigel胶用无血清的细胞培养基稀释至300 μl/ml，取100 μl均匀涂抹一层于细胞培养池的PET膜上表面，然后将培养池轻轻放入24孔板孔内，37℃放置3 h左右，取出于超净工作台过夜干燥。

注：如进行迁移实验，则跳过这一步骤

4．在下室（即24孔板底部）加入600－800 μl 含10％血清的培养基，上室加入100－150 μl细胞悬液，继续在孵箱培养24 h；

5．将其下表面浸泡在70%甲醇溶液中，固定30 min~60 min，用结晶紫或台盼蓝染色，镜检，并计算PET膜下表面的细胞数，计算中间和四周5个视野，取平均值。

        实验结果

镜下对染色后的细胞进行计数，计数值高，则该组细胞迁移/侵袭能力强。

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