干细胞的培养

　　培养前的工作准备充分
 

　　包括耗材的处理、试剂的配置，无菌检验等等。
 

　　玻璃器皿的清洗。对于玻璃器皿(细胞瓶、装营养液的瓶子、小青霉素瓶等)要先用洗衣粉刷干净(注意死角)，然后冲干净。用酸液浸泡 24 h 以上，之后用清水冲洗 10 遍，除去残留酸液。瓶子之类，冲洗过程要使劲摇晃。然后在双蒸水浸泡 24 h。晾干后包扎，使用鼓风干燥箱160℃ 干烤 2 h 待用。
 

　　试剂配置。细胞培养用的液体一般使用双蒸以上的水即可。并注意 pH 值的调节。
 

　　无菌检验。主要采用过滤除菌：如胰酶、抗生素、G-418 溶液、各类培养基、丙酮酸钠、谷氨酰胺等。有些可以采用高压灭菌：如 PBS、D-Hank's等。
 

　　试剂分装保存
 

　　包括营养液、胰酶、血清等。
 

　　血清特别重要。血清必须贮存于 –20℃低温培养箱，如果一次无法用完一瓶，可将 40～50ml 分装于无菌酸处理瓶中，甚至置青霉素瓶保存。一般厂商提供的血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。(一般情况下不影响细胞培养)
 

　　瓶装血清一定要逐步解冻: 4℃ 冰箱全溶后再分装，在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由 –20℃ 直接至 37℃ 解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。
 

　　热灭活是指 56℃，30 分钟加热已*解冻之血清。水浴锅升到 56℃后，将血清放入，待温度升高到 56℃ 后计时，一般 5 分钟左右规则摇晃均匀一次。此热处理之目的是使血清中之补体成份去活化。除非必须，一般不要作此热处理，因为会造成沉淀物之显著增多，且会影响血清之品质。注意更换新血清(包括不同批次)对细胞的影响。
 

　　无菌意识要强
 

　　实验进行前，超净台以紫外灯照射 30 分钟灭菌，以 70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启超净工作台风扇运转数分钟后，才开始实验操作。
 

　　每次操作只处理一株细胞株，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以 70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。
 

　　无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如支架、吸管等公用物品可以暂时放置，其它个人实验用品用完应立即拿出。实验用品以 70% 乙醇擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在中央无菌区域，一般勿在边缘区域操作。
 

　　小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约 45° 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
 

　　选择正确的培养基
 

　　不同的细胞可能培养基不同，甚至不同的文献可能对相同的细胞培养基成分也是可能不同的。当时培养神经干细胞，有文献就选用 neurobase 培养基，实验目的主要是做抗氧化和氧化方面的，而这种培养基中含有抗氧化剂成分，此时，不得不选择另外一种不含抗氧化剂的培养基。
 

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