应用霉菌培养箱进行真菌体内致病性研究：方法与金标准验证

摘要：在医学真菌学研究领域，明确病原真菌的致病性是理解其发病机制、评估治疗策略及开发新药的核心。利用动物模型进行体内感染实验，被视为验证真菌致病性的“金标准”。本方案旨在阐述如何系统性地建立并评估真菌动物感染模型，其中霉菌培养箱在关键步骤中扮演着的角色，用于量化真菌负荷与评估感染进程。

一、 研究目标与核心思路

本研究旨在通过标准的动物感染模型，评估目标真菌菌株（如临床分离株、基因敲除/过表达株）的体内致病能力强弱。核心思路是：将真菌以特定方式接种于易感动物，随后通过一系列终点指标（生存率、组织载菌量、病理损伤），客观、定量地比较不同菌株的毒力差异。整个过程高度依赖于霉菌培养箱对回收真菌的准确培养与计数。

二、 动物感染模型的建立

实验动物选择：

常用模型：小鼠是泛使用的模型动物。根据研究目的，可选择免疫正常的野生型小鼠，或免疫缺陷小鼠（如中性粒细胞减少症模型、Cyclophosphamide处理小鼠），后者对条件致病真菌（如曲霉、念珠菌）更为敏感，能模拟免疫功能低下宿主的严重感染。

感染方式与途径：

全身播散性感染模型：通过尾静脉注射一定浓度的真菌孢子或酵母细胞悬液。此模型用于研究真菌的全身性定植、扩散能力及对抗真菌药物的全身疗效。

侵袭性肺曲霉病模型：通过鼻腔吸入或气管内接种孢子悬液。这是研究见侵袭性真菌病——侵袭性肺曲霉病的经典模型。

皮肤或皮下感染模型：在剃毛皮肤表面涂抹或进行皮下注射，用于研究皮肤癣菌或皮下真菌病的致病过程。

三、 致病性评估的核心指标与方法

感染模型建立后，需通过以下多维度的指标进行系统评估：

生存率分析：最直接、力的终点指标。

方法：设立对照组（如PBS注射）与实验组（接种不同菌株），每日观察并记录动物的生存状态。

数据分析：绘制Kaplan-Meier生存曲线，使用Log-rank检验比较不同组间的生存率差异。生存期显著缩短的组别，其感染菌株的毒力更强。

组织器官真菌载量定量分析：关键量化指标，依赖霉菌培养箱完成。

方法：在感染后设定的时间点（如24h, 48h, 72h, 7天）处死动物，无菌采集目标器官（肺、肝、脾、肾、脑等）。

匀浆与培养：将组织称重后加入无菌PBS进行匀浆。取适量匀浆液进行系列稀释，涂布于选择性固体培养基（如含氯霉素的SDA平板）上。

霉菌培养箱的作用：将涂布后的平板置于霉菌培养箱中，在适宜真菌生长的温度（通常25-30℃或37℃，视菌种而定）下培养24-72小时。

结果判定：计数平板上的菌落形成单位，并根据稀释倍数和器官重量，计算每克组织中的CFU数量。载菌量越高，表明真菌在该组织中的增殖和定植能力越强。

组织病理学分析：直观显示真菌-宿主相互作用的形态学指标。

方法：取部分组织用福尔马林固定，石蜡包埋后切片。

特殊染色：采用过碘酸希夫染色（PAS）或六胺银染色（GMS），这些染色能特异性地将真菌细胞壁染成红色或黑褐色，使其在组织背景下清晰可见。

镜下观察：在光学显微镜下评估：

真菌侵袭程度：菌丝/孢子在组织中的分布范围、深度。

菌丝形态：观察体内菌丝形态是否与体外培养一致。

宿主反应：炎症细胞浸润类型（中性粒细胞、巨噬细胞等）、组织坏死、肉芽肿形成等病理变化。

四、 霉菌培养箱在本研究中的核心价值

在整个研究链条中，霉菌培养箱并非仅是一个培养工具，而是实现定量化、标准化评估的基石：

精准定量：通过提供稳定、均一的培养环境，确保从组织中回收的真菌能够可靠地形成可见菌落，使得CFU计数准确可靠，这是比较不同菌株或不同处理组间毒力差异的客观数据基础。

标准化操作：所有组织样本在相同的培养条件下处理，避免了因培养条件波动引入的误差，保证了实验结果的重复性与可比性。

结论：综合利用动物模型与霉菌培养箱等关键技术，建立系统的体内致病性研究方案，是解析真菌毒力因子、评估新型抗真菌药物或宿主导向疗法效能的黄金法则。其中，霉菌培养箱在将“感染”这一生物学过程转化为可精确测量的“数据”（CFU/g组织）方面，发挥着不可替代的核心作用，为真菌致病机理研究与防控策略开发提供了坚实的技术支撑。