海马神经元细胞分离培养实验

海马神经元细胞分离培养实验
1、仪器
CO2细胞培养箱，解剖镜，眼科镊，眼科剪
2、动物
新生鼠（SD大鼠）
3、耗材
DMEM/F12培养基、聚赖氨酸
实验步骤：
包被：培养前一天将培养板或培养瓶或皿用0.01%多聚赖氨酸包被过夜。第二天早上来吸除包被液在无菌超净台中自然晾干后放置于CO2细胞培养箱中备用。
配制神经元专用培养基（DMEM/F12培养基中添加1%谷氨酰胺，2% B27，1%双抗）
取脑：选取新生24h之内的SD大鼠数只,雌雄不限,75%酒精全身消毒,断头处死,无菌条件下分层剪开头皮,颅骨,用弯镊拉开脑区视野，小心取出全脑，用预冷的PBS洗数次；
分离：以脑中线为起点，小心拨开大脑颞叶皮层，暴露出新月状海马回，小心夹出海马组织，置于预冷的PBS中，仔细剔除微血管，用眼科剪充分剪碎组织。
消化：加入同体积0.125%的胰蛋白酶，放入CO2细胞培养箱中消化30分钟，期间每隔5分钟轻摇一下。
过滤：加入数滴胎牛血清终止消化，用吸管轻轻吹打细胞数分钟，至液体成米糊状即停止吹打，动作务必轻柔，用200目细胞筛过滤收集细胞悬液。
接种：1000rpm离心5分钟，去除上清，用DMEM/F12培养基重悬细胞，轻轻吹打，调整细胞浓度为100000个每毫升，接种于包被好禁止晃动；
换液：6小时后将DMEM/F12培养液全量换成神经元专用培养液，第48小时后加入一定浓度的阿糖胞苷，以抑制非神经元细胞过度生长，随后每3天半量换液。