细胞瞬时转染原理及实验步骤

       细胞复苏

       细胞复苏是将保存在液氮或-80℃冰箱中的细胞株解冻并重新培养的过程。细胞复苏的关键是快速。防止在解冻过程中，产生的水珠形成冰晶损伤细胞。细胞复苏一般步骤如下：

       1. 预先加热水浴锅，温度至 37-40℃，并在离心管中准备好 10mL 培养基

       2. 从液氮罐或冰箱中取出细胞，迅速放进预热的水浴锅中，镊子夹住冻存管晃动，使其受热均匀

       3. 当冻存管内*融化时，注意用酒精擦拭冻存管消毒，将液体倒入含有 10mL 培养基的离心管中

       4. 离心 5min，去除上清，得到沉淀

       5. 用培养基悬浮沉淀，并接种到培养瓶常规细胞培养

       细胞复苏后，生长一段时间，95%的细胞贴壁生长，细胞状态良好，说明细胞复苏成功。

       

       瞬转步骤

       以 Lipofectamine 转染试剂为例的操作流程，不同转染试剂参考说明书

       1. 将复苏后常规培养的细胞按照 1-3x105 接种到 6 孔板中，加入 2-4mL 的*培养基，混匀放置在气套式二氧化碳培养箱中 37℃过夜

       2. 无菌状态下配置如下溶液：

       a 用 100ul 的无血清培养基稀释 2ug 的待转染的质粒

       b 用 100ul 的无血清培养基稀释 25ul 的 Lipofectamine 转染试剂（血清的存在会影响细胞转染效率，因此要使用无血清培养基转染）

       3. 将 ab 溶液混合并摇匀，室温下放置 30min 左右

       4. 细胞培养至 80%单层左右，用无血清培养基洗涤细胞 2 次，每孔加入 1mL 的无血清培养基，并将混合后的 ab 溶液逐滴加入到每孔，按十字方向轻摇混匀，气套式二氧化碳培养箱中 37℃培养 24 小时

       5. 将转染液倒出，换为*培养基继续培养，培养 3-4 天后检测蛋白表达量

       转染检测

       收集培养的细胞，采用超声或酶解的方法破碎细胞，离心得到上清。转染后的检测主要包括基因水平和蛋白水平的检测。针对基因水平，使用普通 PCR 或 RT-PCR 进行验证，或可使用先达基因ERA法进行检测，简单，快速，准确。蛋白水平，使用 western blot 检测。