用恒温水浴锅提取动物组织细胞基因组DNA

        一、仪器及试剂

        ⒈仪器：

恒温水浴锅、台式离心机、紫外分光光度计（GeneQuant）、移液器、玻璃匀浆器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）

        ⒉试剂：

（1）细胞裂解缓冲液：

Tris (pH8.0) 100 mmol/L

EDTA (pH 8.0) 500 mmol/L

NaCL 20 mmol/L

SDS 10%

胰RNA酶 20ug/ml

（2） 蛋白酶K： 称取20mg蛋白酶k溶于1ml灭菌的双蒸水中，?C20℃备用。

（3）TE缓冲液（pH 8.0）：高压灭菌，室温贮存。

（4）酚： CHCl3：异戊醇（25:24:1）

（5）异丙醇、冷无水乙醇、70%乙醇、灭菌水。

        二、操作步骤

        ⒈取新鲜或冰冻动物组织块0.1g（0.5cm3），尽量剪碎。置于玻璃匀浆器中，加入1ml的细胞裂解缓冲液匀浆至不见组织块，转入1.5ml 离心管中，加入蛋白酶K （500ug/ml）20μl，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，也可转入37℃水浴12～24h，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000 rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。

        ⒉加2倍体积异丙醇，倒转混匀后，可以看见丝状物，用100ul 吸头挑出，凉干，用200ul TE 重新溶解。（可进行PCR反应等，需要进一步纯化的按下列步骤进行）

        ⒊加等量的酚? CHCl3?异戊醇振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

        ⒋取上层溶液至另一管，加入等体积的 CHCl3?异戊醇，振荡混匀，离心12000 rpm，5min。

        ⒌取上层溶液至另一管，加入1/2体积的7.5mol/L乙酸氨加入2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀2min ，离心12000 rpm ,10min。

        ⒍小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉。

        ⒎用1ml 70%乙醇洗涤沉淀物1次，离心12000 rpm ， 5min。

        ⒏小心倒掉上清液，将离心管倒置于吸水纸上，将附于管壁的残余液滴除掉，室温干燥。

        ⒐加200ul TE重新溶解沉淀物，然后置于4℃或?C20℃保存备用。

        ⒑吸取适量样品于GeneQuant上检测浓度和纯度。

        三、常见问题

        ⒈选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。

        ⒉在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。

        ⒊提取的DNA不易溶解：不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。沉淀物太干燥，也将使溶解变得很困难。

        ⒋电泳检测时DNA成涂布状：操作不慎；污染核酸酶等。

        ⒌分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。在这种情况下，应加入SDS  至终浓度为0.5%，并重复步骤2～8。

        ⒍酚/ CHCl3/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：含高浓度的DNA，可加大抽提前缓冲液的量或减少所取组织的量。