蛋白的定量浓度实验之恒温培养箱应用

     今天喆图小编来给大家讲讲用恒温培养箱做蛋白定量浓度实验：

     1、吸弃培养皿中的培养液。

     2、往培养皿中加入2ml冷的PBS轻轻荡洗2~3次，MAX后一次，吸干培养皿中的PBS。

     3、每个培养皿中加入70μl（以FLS细胞为例）裂解液。

裂解液的配置：

     RIPA裂解液：蛋白酶/磷酸酶抑制剂混合物：RIPA裂解液（中）B液=100：1：1

     4、将加入裂解液的培养皿轻轻摇晃，使裂解液与贴壁细胞充分接触，放入—70℃的低温冰箱，冷冻10分钟。

     5、裂解完后，用干净的刮刀将细胞刮于培养皿的一处，然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。

     6、将离心管置于小型离心机上涡旋一下，然后置于4℃低温冰箱放置30min。

     7、将离心管放入高速离心机，于4度下12000rpm离心5min。

     8、取出离心管，吸取上清液，上清液即蛋白液，对其进行定量，转移至新的1.5ml离心管。

     9、对提取的上清液进行蛋白浓度的定量

蛋白定量的过程

     ①取干净的96孔板，进行区域选择板底扫描即读板

     ②首先在96孔板中加入18ul的PBS

     ③在18ul的PBS中加入2ul的样品

     ④MAX后在加入200ul的BCA（加入后的BCA不进行与样品的混合，而是铺在样品的上面，用吹风机除去上方的气泡）

     BCA的配置：BCA试剂A：BCA试剂B=50：1

     ⑤放置37°恒温培养箱孵育30min

     ⑥读板（吸光光度值为562）

     10、对剩余的样品按照体积5：1的比例加入Loading Buffer（6X）

     11、将加好的样品放入离心机顺离，使离心管内壁的样品甩下。

     12、将样品放入恒温金属浴锅中100℃煮7min

     13、将煮好的蛋白放入—20℃低温冰箱中备用

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