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细菌突变试验

发表时间:2019-04-11  |  点击率:278

      电热恒温培养箱恒温水浴锅振荡水浴摇床、压力蒸汽消毒器、干热烤箱、低温冰箱(-80℃)或液氮生物容器、普通冰箱、天平(精密度0.1g和0.0001g)、混匀振荡器、匀浆器、菌落计数器、低温高速离心机,玻璃器皿、生物安全柜等。

      培养基和试剂

      0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L色氨酸-0.5mmol/L生物素溶液

成分:

L-组氨酸(MW155)

78mg

 

D-生物素(MW244)

122mg

 

L-色氨酸(MW204)

102mg

 

加蒸馏水/去离子水至

1000mL

       配制:将上述成分加热,以溶解生物素,然后在0.068MPa下高压灭菌20min。贮于4℃冰箱。若试验中不使用大肠杆菌,则不添加色氨酸。

        顶层琼脂培养基

成分:

琼脂粉

1.2g

 

氯化钠

1.0g

 

加蒸馏水/去离子水至

200mL

        配制:上述成分混合后,于0.103MPa下高压灭菌30min。实验时,加入0.5mmol/L组氨酸-0.5mmol/L色氨酸-0.5mmol/L生物素溶液20mL。若试验中不使用大肠杆菌,则不添加色氨酸。

         Vogel-Bonner(V-B)培养基E

成分:

枸橼酸(C6H8O7·H2O)

100g

 

磷酸氢二钾(K2HPO4)

500g

 

磷酸氢铵钠(NaNH4HPO4·4H2O)

175g

 

硫酸镁(MgSO4·7H2O)

10g

 

加蒸馏水/去离子水至

1000mL

      配制:先将前三种成分加热溶解后,再将溶解的硫酸镁缓缓倒入容量瓶中,加蒸馏水/去离子水至1000mL。于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4℃冰箱。

       20%葡萄糖溶液

成分:

葡萄糖

200g

 

加蒸馏水/去离子水至

1000mL

      配制:加少量蒸馏水/去离子水加温溶解葡萄糖,再加蒸馏水/去离子水至1000mL。于0.068MPa下高压灭菌20min。储于4℃冰箱。

      底层琼脂培养基

成分:

琼脂粉

7.5g

 

蒸馏水/去离子水

480mL

 

V-B培养基E

10mL

 

20%葡萄糖溶液

10mL

       配制:首先将前两种成分于0.103MPa下高压灭菌30min后,再加入后两种成分,充分混匀倒底层平板。按每皿25mL制备平板,冷凝固化后倒置于电热恒温培养箱中24h,备用。

      营养肉汤培养基

成分:

:C8H9Cl

2.5g

 

胰胨

5.0g

 

磷酸氢二钾(K2HPO4)

1.0g

 

加蒸馏水/去离子水至

500mL

      配制:将上述成分混合后,于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4℃冰箱。

      盐溶液(1.65mol/L KCl+0.4mol/L MgCl2)

成分:

(KCl)

61.5g

KCl

氯化镁(MgCl2·6H2O)

40.7g

 

加蒸馏水/去离子水至

500mL

      配制:在水中溶解上述成分后,于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4℃冰箱。

      0.2mol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)

成分:

磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)

2.965g

 

磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)

29.015g

 

加蒸馏水/去离子水至

500mL

      配制:溶解上述成分后,于0.103MPa下高压灭菌30min。储于4℃冰箱。

      S9混合液

成分:

每毫升S9混合液

 

肝S9

100μl

 

盐溶液

20μl

 

灭菌蒸馏水/去离子水

380μl

 

0.2mol/L磷酸盐缓冲液

500μl

 

辅酶II(NADP)

4μmol

 

6-磷酸葡萄糖(G-6-P)

5μmol

       配制:将辅酶II和6-磷酸葡萄糖置于灭菌三角瓶内称重,然后按上述相反的次序加入各种成分,使肝S9加到已有缓冲液的溶液中。该混合液必须临用现配,并保存于冰水浴中。实验结束,剩余S9混合液应该丢弃。

       菌株鉴定用和特殊用途试剂

       组氨酸-色氨酸-生物素平板

成分:

琼脂粉

15g

 

蒸馏水/去离子水

934mL

 

(V-B)培养基E

20mL

 

20%葡萄糖

20mL

 

灭菌盐酸组氨酸水溶液(0.5g/100mL)

10mL

 

灭菌盐酸色氨酸水溶液(0.5g/100mL)

10mL

 

灭菌0.5mmol/L生物素溶液

6mL

       配制:高压灭菌琼脂和水后,将灭菌20%葡萄糖,V-B培养基、组氨酸溶液,加进热的琼脂溶液中(若试验中不使用大肠杆菌,则不添加色氨酸,同时蒸馏水/去离子水改为944mL)。待溶液稍微冷却后,加入灭菌生物素,混匀,浇制平板。

       氨苄青霉素平板和氨苄青霉素/四环素平板

成分:

琼脂粉

15g

 

蒸馏水/去离子水

930mL

 

(V-B)盐溶液

20mL

 

20%葡萄糖

20mL

 

灭菌盐酸组氨酸溶液(0.5g/100mL)

10mL

 

灭菌盐酸色氨酸水溶液(0.5g/100mL)

10mL

 

灭菌0.5mmol/L生物素溶液

6mL

 

氨苄青霉素溶液(8mg/mL于0.02mol/L NaOH中)

3.15mL

 

四环素溶液(8mg/mL于0.02mol/L HCl中)

0.25mL

         配制:琼脂和水高压灭菌20min,将无菌的葡萄糖、VB盐溶液、组氨酸溶液和色氨酸溶液,加进热的琼脂溶液中,混匀(若试验中不使用大肠杆菌,则不添加色氨酸,同时蒸馏水/去离子水改为加940mL)。冷却至大约50℃,无菌条件下加入四环素溶液和/或氨苄青霉素溶液。

         应该在倾注琼脂平板后几天内,制备主平板。

         营养琼脂平板

成分:

琼脂粉

7.5g

 

营养肉汤培养基

500mL

        配制:于0.103MPa下高压灭菌30min后倾注平板。

      试验菌株及其生物学特性鉴定

      试验菌株

采用以下菌株作为标准组合:

鼠伤寒沙门氏菌TA1535;

鼠伤寒沙门氏菌TA97或TA97a或TA1537;

鼠伤寒沙门氏菌TA98;

鼠伤寒沙门氏菌TA100;

鼠伤寒沙门氏菌TA102或大肠杆菌WP2uvrA或大肠杆菌WP2uvrA(pKM101);

      生物学特性鉴定

新获得的或长期保存的菌种,在试验前必须进行菌株的生物特性鉴定。

以上内容仅供参考!

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