植物组织培养

     今天喆图小编以大豆子叶为外植体，在MS培养基上附加不同浓度、不同种类的植物激素，以研究不同激素组合和不同浓度对大豆子叶愈伤诱导率的影响。

接下来给大家讲讲实验与方法所需实验材料：大豆子叶

实验所需试剂与仪器：
     试剂：75%酒精、MS干粉、蔗糖、琼脂、植物生长调节剂、无菌水、生汞、NaOH溶液
     仪器：超菌净工作台、圆纸片、培养皿、封口膜、称量纸、千分之一天平、不锈钢杯子、移液枪、试管、高压灭菌锅、注射器、酒精灯、镊子、手术刀、搁置架、烧杯、加热板。

实验方法
配制培养基的准备阶段
   （1）准备60个培养试管及封口膜，2个小培养皿、1个大培养皿，用洗衣粉、自来水洗净，再用蒸馏水把每个培养试管、润洗一下，于鼓风干燥箱120℃中烘干后将试管编号1-60。

   （2）在称量纸上用百分之一天平分别称取1.5g 琼脂4份，7.5g 蔗糖4份，在烧杯里用千分之一天平上称取1.185g MS干粉4份。
   （3）剪小圆纸片40张，均分在两个小培养皿中大小能从中自由取出为宜；剪大圆纸片10张，均分在两个大培养皿中，然后分别用报纸包好。

   （4）把接种工具手术刀、镊子、剪刀等用报纸包好。

配制培养基
      1、在装有MS干粉的烧杯中按下表加入植物生长调节剂 实验所用的所有激素浓度均为0.5mg/mL。

      2、用量筒量取250ml蒸馏水，取一个不锈钢杯子加入150ml蒸馏水和称量好的琼脂，在加热板上加热沸腾2min，再加入混合好的MS培养基1号和蔗糖，混合沸腾2min，用剩余的蒸馏水定容至250ml；
      3、当温度降到60℃左右时，将溶液pH 调至5.8，一般加4滴NaOH溶液即可；
      4、取编号1-20的培养试管，用大量注射器以每瓶12.5ml 左右培养基分装在培养试管中，用封口膜封口，4支一捆捆扎好。
      5、用相同的方法配置2-4号培养基，并分装、捆扎。

 高压湿热灭菌
     ①将包好的接种工具，包好的培养皿，以及分装好的试管一起放到高温灭菌锅中用二次排气法在121℃灭菌20min。

     ②高压灭菌锅操作
      先关闭高压灭菌锅放气阀, 待锅内压强升到0.05MPa时, 打开放气阀排出空气, 当压力表指针为0MPa时关闭放气阀。继续加热, 当压力表再次升到0.05MPa时, 再一次排除灭菌锅内的空气, 使压力表指针再次降为0MPa，关闭放气阀。继续加热,让锅内的压力上升到一个大气压（0.103MPa），此时锅内温度为121.6℃时，控制热源，维持压力。20min后，灭菌结束，待高压锅内压力表指针恢复到零后，开启压力锅。

接种
       实验前准备工作取50粒左右大豆子叶，分成单瓣，在洗衣粉水中仔细清洗，再用流水冲洗，备用；
        接种前，用甲醛+高锰酸钾熏蒸接种室和培养室，将培养基及接种工具放入超净工作台台面，打开鼓风机，打开紫外杀菌灯；
        洗净双手，用75%酒精擦拭双手，并用75%的酒精擦拭超净工作台台面和有关工具，同时喷洒接种室。

植体的灭菌
        将洗好的大豆子叶在75%的酒精中浸泡8s，把酒精倒出，迅速加入无菌水漂洗两次，再放入生汞中浸泡2min，并用镊子不断搅拌，倒掉氯花汞，用无菌水漂洗7次，漂洗时，后几次无菌水要在大豆子叶中稍许停留。MAX后转移到大培养皿中备用。大培养皿放入少许无菌水，浸湿大豆子叶。
外植体的切割
      （1）在火焰旁打开包接种工具的报纸，将接种工具在95%酒精中浸泡，然后用酒精灯灼烧，手不能接触接种器械的前半部分，用火灼烧镊子或手术刀要冷却后方可用于外植体的接种，防止烫伤材料，两把镊子可轮换使用；
      （2）待接种工具冷却后，用手术刀对大豆子叶进行切割，切割时，一次取4粒大豆子叶放入小培养皿中，同方向切割完毕后选装方向，将四个方向都切下后，再在中间补一刀，不要切穿。

外植体的接种
       在火焰旁打开试管封口膜，使试管口在火焰上过一下，然后把切好的子叶放入培养基上，操作管呈倾斜状态，防止菌从口掉入，将管口再次在火焰上过一下，扎上封口膜。待所有培养试管接种完后，4个一组捆扎，放置在培养架上。

观察
      在25℃光照培养箱中关闭光照，黑暗下培养一周并观察。
       一周后，设置为25℃，打开光照，继续培养一周，并观察。

      两周后，观察培养试管中大豆子叶生长情况！

      以上内容仅供参考，如需了解详情请联系喆图客服！