菌种的扩大培养

      种子培养期染菌的危害MAX大，因严格防止。一旦发现种子染菌，均应灭菌后弃去，并对种子罐及其管道进行*灭菌。发酵前期养分丰富，容易染菌，此时养分消耗不多，应将发酵液补足必要养分后迅速灭菌，并重新接种发酵。发酵中期染菌不但严重干扰生产菌株的代谢，而且会影响产物的生成，甚至使已形成的产物分解。由于发酵中期养分已被大量消耗，代谢产物的生成又不是很多，挽救处理比较困难，可考虑加入适量的抗生素或杀菌剂。如果是发酵后期染菌，此时产物积累已较多，糖等养分已接近耗尽，若染菌不严重，可继续进行发酵;若污染严重，可提钱放罐。染菌程度越重，危害越大;染菌少，对发酵的影响就小。所以喆图小编给大家讲讲实际生产中，应当根据污染程度和发酵时期区别对待。

        1 实验器材与试剂

1.1 器材

热空气消毒箱、超净工作台、振荡培养箱、显微镜、天平、三角瓶、试管、移液管、培养皿、 接种针、平板涂布器、酒精灯、载玻片

1.2 试剂 营养琼脂、葡萄糖、磷酸二氢氨、七水合硫酸镁、氯化钠、磷酸氢二钾、C8H9Cl、蛋白胨、0.4%酚红溶液、蒸馏水、番红染液、香柏油、擦镜液

        1.3培养基

(1)营养琼脂培养基：直接称量营养琼脂粉4.5g，溶于100mL蒸馏水配制，pH7.2，分装到试管中， 灭菌后摆成斜面。

(2)种子培养基：葡萄糖 0.5%、磷酸二氢氨 0.1%、七水合硫酸镁 0.02%、氯化钠 0.5%、磷酸氢二钾 0.1%

(3)葡萄糖酚红肉汤培养基：C8H9Cl 0.3%、蛋白胨 0.8%、 葡萄糖 0.5%、 氯化钠 0.5%、 0.4% 酚红溶液，pH7.2

        2实验方法

2.1种子的扩大培养

2.1.1斜面培养基的配制

配制营养琼脂培养基，分装，灭菌(121℃条件下灭菌 30min)，倒斜面。

        2.1.2菌种的活化

⑴将大肠杆菌采用无菌操作的方法接种于斜面上，恒温培养箱37 ℃下培养18h;

⑵培养 18h 后，观察菌落颜色是否一致，若均为黄色，挑取培养皿周边的菌落进行无菌检测;若颜色有黄有白，则两种颜色的菌落均要进行无菌检测。检测方法常用染色镜检，若检测后，没有污染，便可进行扩大培养;若检测到杂菌，要重复上述步骤，直到无菌为止，否则，不能继续下一步操作。

        2.1.3扩大培养

在无菌条件下，从检测后的活化培养基上挑取10个左右菌落，用接种针接种到扩大培养基(即种子培养基)中，于37℃下振荡培16-18h，观察菌落形态。然后配合显微镜形态观察，根据结果来判断能否进行下一步。

        2.2污染的检测和判别

        2.2.1显微镜检查

⑴取样：用无菌操作方式取发酵液少许,涂布在载玻片上;

⑵制片、染色：自然风干后,用番红染液染色 1-2min，水洗;

⑶干燥后用油镜下观察。

2.2.2平板检查

⑴配制营养琼脂培养基，灭菌，倒平板;

⑵取少量待检发酵液经稀释 (大约 10–6～10–7) 后涂布在营养琼脂平板上，在电热恒温培养箱中 37℃下培养 24h;

⑶观察菌落形态。

2.2.3肉汤培养检查法(用于检测培养基灭菌是否*)

将1ml待测液(灭菌处理后的种子培养基)接入葡萄糖酚红肉汤培养基中，于37℃下培养24h，观察培养基的状态和颜色。

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