细胞冻存及复苏实验

大家好今天喆图小编给大家带来的是使用恒温培养箱、恒温水浴锅做细胞冻存和复苏实验。

实验方法原理

        细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

实验材料 细胞 
仪器、耗材 微量加样枪、吸头、离心管、冻存管、枪头胶、塞移液管、玻璃瓶、红血球计数板、记号笔、医用橡皮、膏移液枪、超净工作台、离心机、恒温水浴箱、冰箱、倒置相差显微镜、恒温培养箱、液氮冰箱、

1. 仪器：净化工作台、 离心机、恒温水浴锅、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差显微镜、恒温培养箱、液氮冰箱。

3. 塑料器皿： 吸头、枪头、胶塞、移液管（10ml）、15ml离心管、冻存管（1～2ml）。

5. 试剂：D-Hanks液、小牛血清、培养液、双抗（青霉素、链霉素）、胰蛋白酶（0.08%）、1NHCl、7.4%NaHCO3、DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油。

1. 配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的冻存培养液。

3. 离心1 000 rpm，5 min。

5. 将细胞分装入冻存管中，每管1～1.5 ml。

7. 冻存：标准的冻存程序为降温速率-1～-2℃/ min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃时，则可迅速浸入液氮中。也可将装有细胞的冻存管放入-20℃冰箱2 h ，然后放入-70℃冰箱中过夜，取出冻存管，移入液氮容器内。

1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入水浴锅37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。

3. 离心， 1 000 rpm，5 min。

5. 次日更换一次培养液，继续培养。收起

 2. 将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤。

其他

二、慢冻程序

2. 简易程序：将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1~2 ℃的速度，在40 min内降至液氮表面过夜，次晨投人液氮中。

 三、低温保护剂的应用 在细胞冻存时加入温保护剂，能大大提高冻存效果。 常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。

1. 预先配制冻存液 （1）10%DMSO + 细胞生长液（20%血清+基础培养液） （2）10%甘油+ 细胞生长液（20%血清+基础培养液）

3. 加入1 ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。液氮长期保存。

1. 快速解冻 冻存细胞从液氮中取出后，立即放入3中，轻轻摇动冷冻管，使其在1 分钟内全部融化（不要超过3 分钟）。

3. 如果细胞对冷冻保护剂特别敏感 解冻后的细胞应先通过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含*生长培养液的培养瓶中。

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