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仙人掌中生物碱类提取物抗肿瘤作用的研究

发表时间:2018-11-22  |  点击率:581

   仙人掌肉质茎中含有多种生物碱, 其中主要为酪胺、N- 甲基酪胺、3- 甲氧基酪胺、β- 苯乙胺、大麦芽碱等酪胺更是仙人掌中生物碱的重要成分。接下来给大家介绍用CO₂培养箱从仙人掌里面提取生物碱时所需设备及实验方法如下:

实验对象:HL-60细胞

   提取实验所需仪器:荧光倒置显微镜、净化工作台、1640培养基、高速冷冻式离心机、实验室超纯水器、立式压力蒸汽灭菌器、酶标仪、离心沉淀器、远红外干燥箱、恒温加热磁力搅拌器、转蒸发仪、电热恒温水浴锅、循环水式真空泵、紫外分光光度计、电热套、圆底烧瓶、蛇形冷凝管、布氏漏斗、分液漏斗、分析天平、容量瓶、量筒、烧杯、胶头滴管、移液管、比色管。

   实验试剂:Sigmo MTT试剂、台盼蓝染液、1640培养液、乙醇、甲醇、1 mol / L的硫酸,、浓氨水、改良碘化铋钾试剂、酪胺标准溶液、KB r粉末。

方法

    1、仙人掌中生物碱的提取分离与精制将仙人掌粉碎,取细粉20g,在条件为:乙醇浓度95 % 、物料比1∶15 、提取温度50 ℃、提取时间3 h的条件下,乘热抽滤,滤渣再于同一条件下提取2h,乘热抽滤,合并滤液,滤液减压于水浴锅中浓缩,再将滤液放冷析出结晶,得粗提物。向粗提物中加入适量1 mol / L 的硫酸, 形成酸水液和沉淀, 滤去酸水液中的沉淀, 加入适量的浓氨水调至pH 值9 ~10 。然后用分液漏斗萃取3-4h后,用旋转蒸发仪进行浓缩后抽滤,得总生物碱。

   2、仙人掌中生物碱类物质的鉴定

   化学法检查:将提取的总生物碱液,用1%的盐酸萃取,得盐酸溶液10毫升,分为四个小试管储存,分别在四个小试管中加入改良碘化铋钾、碘-碘化钾、硅钨酸试剂,观察各试管中的变化。

   薄层层析检查:取总生物碱少许—丙酮—甲醇(6∶1∶1)溶解, 用毛细管点样于预先制备好的硅胶GF254 板上, 上行法展开。当展开剂跑至硅胶板前沿约1~2cm 处时, 取出, 挥干溶剂。先观察荧光, 后用改良碘化铋钾试剂喷雾显色,观察斑点位置及颜色,同时用酪胺标准品作对照。

   3、白血病
   HL-60细胞培养人早幼粒白血病细胞HL-60培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中,加青霉素100μg·mL-1,链霉素100μg·mL-1,置于5% CO2培养箱中,37℃饱和培养。
   4 、总生物碱的抑瘤实验准备工作把总生物碱提取物用牛皮纸封好口,离心管与培养瓶放在铝制盒里,和替补头一起在压力蒸汽灭菌器里灭菌,20分钟后放入远红外干燥箱干燥后备用。

   5、接种细胞

   取对数期生长的HL-60细胞,用离心机1000rmp离心10min后,小心弃去上清液,分别与0.25%胰蛋白酶消化液、0.02%EDTA混合消化后调节细胞浓度为1×105 个/ml的单细胞混悬液,每孔150ul接种于96孔培养板中,置5% CO2培养箱中,37℃的培养过夜,备用。

   6、加药培养
   将提取物制备成10个不同浓度剂量,分别为:5,10,20,50,100,200,400,600,800,1000ug/ml。

   7、再将不同浓度的提取物

50ul分别加入各接种了HL-60细胞的试验孔中,平行5孔

   8、设置只加细胞,

不加药液的对照孔和只加培养液的空白孔,均平行5孔,继续培养24、48、72h

   9、荧光倒置显微镜观察法测定
在加药培养前和加药培养后的24、48、72h于荧光倒置显微镜下观察实验组与空白组不同时期细胞的生长状态及细胞形态。
   10、MTT法检测
取处于指数生长期的HL-60细胞,用离心机1000rmp离心10min后,小心弃去上清液,分别与0.25%胰蛋白酶消化液、0.02%EDTA混合消化后调节细胞浓度为1×104个/ml的单细胞混悬液,每孔150ul接种于96孔培养板中,并设空白对照孔,只加培养液,不加细胞,置5% CO2,37℃的CO2培养箱中过夜。
   11、换液,加入受试药物,50μl/ 孔,每个浓度设5 个重复,细胞在相同条件下继续培养4 8 h 后,加入MTT20μl/ 孔(5mg/ml),置于37℃ CO2培养箱中、置5% CO2 反应4h。
   12、小心吸去上清液,加入DMSO 溶解,每孔150μl,平板摇床上振摇5min。用酶标仪在波长为570nm 处测定每孔的OD值,测时须减去空白对照,实验重复三次。
   13、计算细胞存活率及药物对细胞的抑制率。
细胞存活率=实验组OD值/对照组OD值×100% 细胞抑制率(%)= (1-实验组OD值/对照组OD值)×100%

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