滤纸糖化力法测定纤维素酶活性条件的研究

       今天喆图小编就来说说利用蛋白质分离纯化方法，从枯草芽孢杆菌中分离出纤维素酶，将其分别作用于羧甲基纤维素（CMC）和滤纸，其生成的还原性糖能和3.5--二硝基水杨酸（DNS）反应生成棕红色物质，利用分光光度法测出纤维素酶的活性强度。

           纤维素酶 

滤纸糖 ———— 纤维二糖、葡萄糖等还原性糖 +DNS ———— 棕红色物质

所需药品材料：氢氧化钠、葡萄糖、3.5--二硝基水杨酸（DNS）、硝酸、冰醋酸、醋酸钠、酒石酸、滤纸、纤维素酶制剂。

试验需用仪器：分光光度计、电热恒温水浴锅、鼓风干燥箱、分析天平

实验设计：

一、实验前期准备工作:

       1、醋酸-醋酸钠缓冲液的配制：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1mol/L醋酸溶液。 称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1mol/L醋酸钠溶液。使用时以4：6的比例混合，放入低温保存箱中冷藏备用。

         2、葡萄糖溶液的配制：将葡萄糖在鼓风干燥箱中105℃下干燥至恒重，准确称取100mg 于100mL 小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入100mL 容量瓶中用蒸馏水定容至100mL，充分混匀。

         3、3.5--二硝基水杨酸的配制：准确称取DNS 6.3g于500mL 大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，加入2mol/L NaOH 溶液262mL，再加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠（C4H4O6KNa · 4H2O，MW=282.22）的热水溶液中，再加5g结晶酚（C6H5OH，MW=94.11）和5g无水亚硫酸钠（Na2SO3，MW=126.04），搅拌溶解，冷却后移入1000mL 容量瓶中用蒸馏水定容至1000mL，充分混匀。

          4、葡萄糖标准曲线的绘制：取8支洗净烘干的25mL 具塞刻度试管，编号后依次加入0ml 0.2ml 0.4ml 0.6ml 0.8ml 1.0ml 1.2ml1.4ml葡萄糖标准溶液,然后用蒸馏水分别定容至2.0ml。配制成一系列不同浓度的葡萄糖溶液。充分摇匀后，向各试管中加入1.5mL DNS溶液，摇匀后放入水浴锅中沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至25mL，充分混匀。在540nm 波长下，以1号试管溶液作为空白对照，调零点，测定其它各管溶液的光密度值并记录结果。以葡萄糖含量（mg）为横坐标，以对应的光密度值为纵坐标，在坐标纸上绘制出葡萄糖标准曲线。

二、滤纸对实验的影响分析：由于滤纸中也含有一定量的还原性糖，所以试验中应该排除底物对实验的影响。称取等量碾碎的滤纸与DNS充分反应，测其OD值。

三、酶促反应时间的研究：酶的反应时间不同，其产物浓度也不一样。依次取反应时间为0min 2min 4min 6min 8min 10min 12min14min的反应体系，加入DNS充分显色测其OD值。

四、DNS试剂量的确定：DNS本身也具有一定的颜色，如果过量也会对实验结果造成影响，所以应该设计实验确定DNS的加入量。取相同酶反应体系，分别加入0.3ml 0.6ml 0.9ml 1.2ml 1.5ml 1.8ml 2.1ml 2.4ml显色剂DNS充分显色，测其OD值。

五、吸收波长的确定：取450nm-590nm波长段，以每20nm一个区段，分别测其OD值，分析结果。

六、沸水浴显色时间的确定：取相同酶反应体系，DNS沸水显色分别取1min 3min 5min 7min 9min 11min 13min 15min的OD值，分析结果。

七、显色后吸光度稳定性的研究：分别测量反应体系显色后15min 20min 25min 30min 35min 40min 45min 50min的吸光度，分析结果。

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